一(yī)、概述

臨床基因擴增實驗又(yòu)稱PCR實驗，是(shì)專門(mén)用↔€(yòng)來(lái)檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的(de)一(yī)種檢測≠≈手段。它可(kě)以通(tōng)過将病毒δ ≤體(tǐ)內(nèi)所含的(de)基因進行(xíng)擴增的÷®∑(de)方法，測出一(yī)些(xiē)病毒含量不(bù)高(gāo)的(de)感染者體(tǐ)內≠§(nèi)是(shì)否含有(yǒu)特定的(de)病毒。更能(néng)夠檢測出最近α•€(jìn)的(de)新型冠狀病毒性肺炎是(shì)否在人(rén)體(tǐ)內(nèi)。±≤

由于該檢測方法可(kě)以測出普通(tōng)檢驗難以檢測出的(de)病毒，并具有(y☆≈λπǒu)靈敏性高(gāo)、特異性高(gāo)、快(kuài)捷、對(duì)樣品要(yào)求低(φ≤​dī)等優點，因此被臨床醫(yī)生(sh•&§ēng)廣為(wèi)認可(kě)，已廣泛應用(yòng)于醫(yī)院的᱕(de)臨床診斷和(hé)各防疫檢測部門(mén)的(de)禽疫病診斷。但(dàn)是(shì♦£≈)，這(zhè)種實驗需要(yào)有(yǒu)能(néγγ↓ng)保證絕對(duì)安全、配置合理(lǐ)的(d™♥$e)實驗室和(hé)非常規範的(de)操作(zuò)為(wèi)前提。

PCR擴增圖解

近(jìn)年(nián)來(lái)對(duì)臨床基因擴增檢驗實驗室的(d™'§e)建設越來(lái)越得(de)到(dào)重視(shì)，因為(wèi)它©‌對(duì)檢測結果的(de)可(kě)靠性、準确性<ε ←和(hé)安全性起到(dào)至關重要(✔₹☆yào)的(de)作(zuò)用(yòng)。

本文(wén)主要(yào)從(cóng)臨床基因擴增檢£δ©驗實驗室的(de)平面布局，空(kōng)調通(tōng)風(fēng)系統設計(jì)、氣÷£流控制(zhì)和(hé)污染的(de)防制(zhì≥↕♠>)幾個(gè)方面對(duì)實驗室設計(jì)中的(deλ✔)主要(yào)特點進行(xíng)了(le)闡述。

臨床基因擴增檢驗實驗室設計(jì)的(de)核心問(wè"☆n)題是(shì)如(rú)何避免污染。因此，實驗室的(de)平面布局、空(kōn₩←←λg)調通(tōng)風(fēng)系統設計(↔γ₹§jì)、氣流控制(zhì)等都(dōu)是(shì)圍繞這(zhè)個(gè)核心問"ε(wèn)題進行(xíng)的(de)。下(xi♠<<à)面就(jiù)對(duì)這(zhè)幾個(gè)方面分(fēn$∞)别進行(xíng)說(shuō)明(míng)。

二、PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢測實驗室原則上(shàng)分§Ω©(fēn)為(wèi)四個(gè)單獨的(de)工(gōng)作(z>®÷uò)區(qū)域：試劑貯存和(hé)準備區(qū)、标本制(zh∏®δ✔ì)備區(qū)、擴增反應混合物(wù)配置和(hé)擴增區(qū)、擴增産物(wù)分(fēn✘∞ε)析區(qū)。為(wèi)避免交叉污染，進入各個(gè)工(gōng)作(zuò→↓)區(qū)域必須嚴格遵循單一(yī)方向進行(xín✘ g)，即隻能(néng)從(cóng)試劑貯存和(hé)準備區(qū)—标本制(zhì)備區("✘qū)—擴增反應混合物(wù)配置和(hé)擴增區(qū)—擴增産物(w±≥ù)分(fēn)析區(qū)。

各實驗區(qū)之間(jiān)的(de)試劑及樣品傳遞$‍♠$應通(tōng)過傳遞窗(chuāng)進行(xíng)。

三、實驗室空(kōng)調通(tōng)風(fēng)系統設計(jì)及壓力控制(z★​→hì)

PCR實驗室并沒有(yǒu)嚴格的(de)淨化(huà)要(yào)求，但(dàn)§÷£是(shì)為(wèi)了(le)避免各個(gè)實驗區(qū) φ±域間(jiān)交叉污染的(de)可(kě)能(néng)性，宜采用(y £₩♥òng)全送全排的(de)氣流組織形式。同€€時(shí)，要(yào)嚴格控制(zhì)  送、排風(fēng)的(de)比例以保證各實驗區(qū)的(de)壓力λ★★✘要(yào)求。

1.試劑貯存和(hé)準備區(qū)

該實驗區(qū)主要(yào)進行(xíng)的(de)操作(zuò)為(¥₩δ'wèi)貯存試劑的(de)制(zhì)備、試劑的(de)分(fēn)裝和(hé&↔)主反應混合液的(de)制(zhì)備。試劑和(hé)用(yòngδ×)于标本制(zhì)作(zuò)的(de)材料應直接運送至該區(qū)，不(bù)$λ$σ得(de)經過其他(tā)區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區<÷(qū)內(nèi)制(zhì)備成所需的(de)貯存試劑。

對(duì)于氣流壓力的(de)控制(zhì)，本區(qū)并沒有(yǒu)嚴格的(de→‌♠)要(yào)求。

2.标本制(zhì)備區(qū)

該區(qū)域主要(yào)進行(xíng)的(de)<♦ 操作(zuò)為(wèi)臨床标本的(de)保存、核酸（RNA、DNA）提取、儲存及其加入至擴增反€$₽應管和(hé)測定RNA時(shí)cDNA的(de)合成。

本區(qū)的(de)壓力梯度要(yào)求為(wèi)：相(xiàng)對(duì)于鄰近(jì""φn)區(qū)域為(wèi)正壓，以避免從(cóng)鄰近(jìn)區(q∑$ū)進入本區(qū)的(de)氣溶膠污染。另外(wài)，由于在加樣操作(zuòδ✘)中可(kě)能(néng)會(huì)發生(shēng)氣溶膠所緻的(de)污染，所以應避免在本®'£₩區(qū)內(nèi)不(bù)必要(yào)的(de)走動☆φ 。

3.擴增反應混合物(wù)配制(zhì)和(hé)擴增區(qū)

該區(qū)域主要(yào)進行(xíng)的(de)操作¥£←(zuò)為(wèi)DNA或cDNA擴增。此外(wài)，已制(zhì)備的(de)DNA模闆和→±₽(hé)合成的(de)cDNA（來(lái)自(zì)樣本制(zhì)備區(qū)）的(de)π<•加入和(hé)主反應混合液（來(lái)自(zì)試劑貯存和( ♣↔™hé)制(zhì)備區(qū)）制(zh✔£♣ì)備成反應混合液等也(yě)可(kě)在本區(qū)內(nèi)進行(xíng)。在巢式PC¥'R測定中，通(tōng)常在第一(yī)輪擴增後必須打開(kāi)反應管，因此γ☆​∞巢式擴增有(yǒu)較高(gāo)的(de)污染危險©$§​性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行(xíng)。

本區(qū)的(de)壓力梯度要(yào)求為(wèi)：相(xi∞∑àng)對(duì)于鄰近(jìn)區(qū)域為(wèi)®☆負壓，以避免氣溶膠在本區(qū)漏出，為(wèi)避免氣溶膠所緻的(de)污↓λ染，應盡量減少(shǎo)在本區(qū)內(nèi)的(≠&de)不(bù)必要(yào)走動。個(gè)别操作(zuò)如(rú)加樣等∞​應在超淨工(gōng)作(zuò)台內(nèi)進行(xín>λ✔εg)。

4.擴增産物(wù)分(fēn)析區(qū)

該區(qū)域主要(yào)進行(xíng↑≤)的(de)操作(zuò)為(wèi)擴增片段的(de)測定。如(rú)使用(yòng)全♠↔π自(zì)動封閉分(fēn)析儀器(qì)檢測，此區(qū)域✔ §可(kě)不(bù)設。

本區(qū)是(shì)最主要(yào)的(de)擴增産物(wù)污染來(l™♥ái)源，因此對(duì)本區(qū)的(de)壓力梯度的(☆×​←de)要(yào)求為(wèi)：相(xiàng)對(duì)于鄰近(jìn)區(qū)域為(wè↔§i)負壓，以避免擴增産物(wù)從(cóng)本區(qū)擴散至其它區(qū)域。

四、污染的(de)預防和(hé)控制(zhì)

PCR實驗室設計(jì)的(de)核心問(wèn)題是(shì)如(rú)♣Ω≠何避免污染。在實際工(gōng)作(zuò)中，常見(jiàn)的(de)有☆λ(yǒu)以下(xià)幾種污染類型：擴增産物(wù)  ≠↔的(de)污染；天然基因組DNA的(de)β×污染；試劑的(de)污染以及标本間(jiān)的(de)污染。由于一(yī)旦發λ​₽™生(shēng)污染，實驗就(jiù)必須停止，直到(dào)找到(dào)污染★✔€源為(wèi)止，而且實驗結果必須作(zuò)廢，需重>α♥新進行(xíng)實驗。所以發生(shēng)污染後再圍繞‍∞實驗室來(lái)尋找污染源不(bù)但(dàn)耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人(rén  ®☆)力物(wù)力。因此要(yào)避免污染，首先應是(shì)預防，而不(bù)是λ♠(shì)排除。

1.工(gōng)作(zuò)區(qū)域的(de)嚴格劃分(fēn)

（1）各個(gè)實驗區(qū)域設置合理(lǐ)；

（2）各個(gè)實驗區(qū)域要(yào)有(yǒu)明(míng)顯的(de♠π)标記（如(rú)醒目的(de)門(mén)牌或不(bùγπ )同的(de)地(dì)面顔色等），以避免各個(gè÷♦)不(bù)同實驗區(qū)域設備物(wù)品、試劑等發≥≈生(shēng)混淆。

2.合理(lǐ)的(de)系統設置

（1）合理(lǐ)的(de)空(kōng)調通(tōng)風(fēng)系統設置，盡量采用(y×βòng)全送全排的(de)空(kōng)調系統；

（2）嚴格的(de)氣流壓力控制(zhì)，保證不(bù)同的(de)實驗≈₩區(qū)內(nèi)不(bù)同的(de)壓力要(yào)求。

3.規範的(de)操作(zuò)

（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的(de)技(jì)術(shù)人(rén)員(yuán)必須進行(x£$σ♠íng)上(shàng)崗培訓，經培訓合格後才能(néng)從(cóng)事(shì>β)臨床基因擴增檢驗工(gōng)作(zuò)；

（2）在實驗操作(zuò)過程中，操作(zuò)者必須戴手套，并經常更換。此外(wàδ¶β®i)，操作(zuò)中使用(yòng)一(yī)次性帽子(zǐ)也(yě)是↓‌←(shì)一(yī)個(gè)有(yǒu)效地(dε ì)防止污染的(de)措施；

（3）清潔工(gōng)作(zuò)及時(shí)、正确。實驗工™"(gōng)作(zuò)結束後，必須立即對(duì)本區(q↔ §ū)進行(xíng)清潔。除常規的(de)消≠ λ€毒液體(tǐ)對(duì)表面進行(xíng)擦拭消毒或₹±紫外(wài)線燈照(zhào)射消毒外(wài)，對(duì)一(yī)些(xi£✔"✔ē)實驗設備還(hái)應進行(xíng)高(gāo)壓消毒處理(lǐ)。

4.嚴格的(de)管理(lǐ)

（1）嚴格控制(zhì)進出實驗室的(de)人(rén)β€≥員(yuán)。與實驗無關的(de)人(rén)員(yuán)不(bù)得¥♣☆(de)随意進出實驗室，有(yǒu)條件(jiàn)的(de)情況下(xià)要₩'(yào)設置獨立的(de)通(tōng)道(dào)和(hé)進出整→₽個(gè)實驗區(qū)的(de)門(mén)；✔♣‌

（2）在各個(gè)實驗區(qū)域使用(yòn€≥₽g)帶有(yǒu)明(míng)顯區(qū'•≈)别标志(zhì)的(de)工(gōng)作(zuò)服（如(rú)不φ±δ(bù)同顔色），當工(gōng)作(zuò)人↓±₹₹(rén)員(yuán)離(lí)開(kāi)時(shí)不(>↑bù)得(de)将本區(qū)的(de)工(gōng)作(zuò) ↑γ服帶至其他(tā)區(qū)域；

（3）盡量減少(shǎo)在實驗區(qū)內(nèi)不(bù)必要(yào)的(de)走動以減'∑少(shǎo)交叉污染的(de)可(kě)能(néng)性；

（4）擴增産物(wù)分(fēn)析區(qū)是(s¶‌hì)最主要(yào)的(de)擴增産物(wù)污染來(lái)源，廢液不(≈β✔αbù)能(néng)在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒後在遠(yuǎn)離(l✔‍ í)實驗室的(de)地(dì)方棄掉，用(yòng)過的(de)吸頭等一(yī)∑☆ε次性材料也(yě)應經消毒液浸泡消毒後統一(yī)處理(lǐ)，如(★♥rú)焚燒等；

（5）擴增産物(wù)分(fēn)析區(qū±♦∏)可(kě)能(néng)會(huì)用(✔'♠✘yòng)到(dào)某些(xiē)可(kě)緻基因突變和(hé)有ε≥(yǒu)毒物(wù)質，應特别注意實驗人(rén)員(yuán)的(de)安全防護。

5.完備的(de)實驗室配套設施

完備的(de)實驗室配套設施是(shì)保證實驗εε₹£工(gōng)作(zuò)的(de)必要(yào)條件(jiàn)，應≈δ¶λ根據各個(gè)實驗室實驗內(nèi)容的(de)™ ←≤不(bù)同配備相(xiàng)應的(de)設備和(hé)儀器(γ‌qì)，如(rú)超淨工(gōng)作(zuò)台、離(lí)心機(jī)、加βλ€¥樣器(qì)等。